一、GLP-1介绍

        胰高血糖素样肽（GLP-1）是一种关键的肠促胰岛素分泌激素。自天然GLP-1发现后，由于在体内的半衰期太短，与其类似的GLP-1结合位点兴奋剂（GLP-1RA）经历了从短效GLP-1药物到长效GLP-1药物的转变过程，在适应症上也从II型糖尿病拓展到减重，并有望进一步扩展到慢性心血管疾病、慢性肾炎、非酒精性脂肪肝和阿尔兹海默症等。

二、GLP-1改造及获取

        已上市的药物中对GLP-1RA多肽原料的获取有化学合成法或者生物合成法两种方法，不同的获取方式需要去除的杂质各不相同，使用的纯化方法也各不相同。

        针对GLP-1各种临床使用目的衍生的长效、短小药物而进行的各种改造修饰方法也各不相同。常见的GLP-1RA长效化改造化学结构修饰主要包括：1、通过对酶切位点进行定点修饰，以减少DPP-4的快速降解；2、通过与白蛋白、抗体或聚乙二醇（PEG）等聚合物结合，增加药物相对分子质量，减少肾脏快速滤过；3、通过与脂肪酸偶联，增加对白蛋白的亲和力，以延长药物作用时间。这些各种形式的修饰方法对应的纯化方法也是各不相同。

三、GLP-1RA的合成方法

        由于多肽分子量相比其他大分子物质蛋白质，其氨基酸数量较少、分子量比较小，一些很小的差异也会导致多肽的电荷性质、疏水性质产生很大变化，这导致不同的获取方法、不同的修饰结构使得各个厂家的样品纯化方式也大相径庭。

1、直接合成法

       直接合成法一般是通过化学反应直接合成目标多肽本身，包括液相合成法和固相合成法。其中液相合成法具有成本低、易于放大等优点，但由于其合成过程需要多次对中间体进行提纯，操作耗时且繁琐，一般只用于10个氨基酸以下多肽的合成；固相合成法是通过将底物固定在树脂上，再逐步添加氨基酸进行反应的方法。固相合成法操作简单，能够快速洗涤、洗涤中间体，容易实现自动化，但合成过程中为了保护活性基团防止副反应发生需要添加一些保护基，这种方法能够合成30个氨基酸左右的多肽。

      固相载体是区分固相合成法和液相合成法的唯一特征，合成过程中使用不同的保护基需要使用不同的固相载体。用于多肽合成的高分子载体主要有三类：交联聚苯乙烯-苯二乙烯、聚乙烯乙二醇类和聚丙烯酰胺类树脂。交联聚苯乙烯-苯二乙烯是最早提出、使用最广泛的材质，在有机溶剂中会溶胀成为一个可以进行偶联反应的基质，其缺点是交联度太低 ，膨胀过大 、不易过滤 、而且机械性能不好，容易破碎。

       相比于生物合成法，其优点是成本低，过程中产生的杂质种类为多肽和氨基酸，不需要经过酶切、复性等操作；其缺点则是由于对应的杂质是合成过程中会产生各种多肽类似物，纯化较为困难，并且无法进行一些更加复杂的修饰。目前直接合成法中由于液相合成法缺点较多，且固相合成法能够一定程度取代液相合成法，所以固相合成法已经成为直接合成多肽的主要方法。

2、生物合成法

       生物合成法一般是使用原核生物进行表达，培养的收获液还要进行变性溶解、复性、酶切等操作，还有一些过滤步骤以去除大颗粒的杂质，然后才能进行纯化。生物合成法相比直接合成法，在得到的粗产品上杂质种类更多。为了方便后续纯化，同时也发挥生物合成的优势，通常会在多肽上添加一些片段，以及一些比较复杂的修饰片段如Fc片段、脂肪酸侧链和his标签等。

       对于添加了his标签的蛋白，可以优先使用Ni离子层析进行纯化，并在结合至层析柱上后进行酶切来去掉his片段，通常一步粗纯即可获得90%以上的纯度；对于添加Fc片段的Fc融合蛋白，可以使用proteinA亲和层析，亲和层析后需要去除的主要杂质是聚体、电荷异质体、HCP、DNA、异构体等，可以通过离子或反相层析进一步精纯。

四、同类公司推荐方法

       目前能够找到的其他公司公开的信息中GLP-1RA纯化推荐方法如下：

博蕴生物：已与修实生物达成合作，全过程使用硅胶基质填料

百林科：his标签蛋白用Ni离子纯化后在层析柱上酶切，然后再反相层析或阴离子层析（有Ni离子层析应用实例数据）；Fc融合蛋白用ProA亲和层析，再使用离子或疏水（有一个亲和层析图谱）；单纯的无标签的GLP-1RA，先使用阴离子去除氨基酸缺失杂质，再使用反相层析去除异构体和副反应物质（无图谱，针对直接合成法的纯化方法）；其他融合蛋白使用脱盐、疏水、蓝胶的流程纯化（无图谱）

蓝晓：直接合成法中氨基酸缺失杂质主要通过离子层析去除，反相层析去除异构体杂质和副反应杂质。培养合成法通过亲和来粗纯，在通过凝胶或疏水进行精纯

五、多肽工艺总结

        多肽获取和纯化大致方法如下：

       这一流程和方法不仅适用于GLP-1RA，同样适用于其他大小类似的多肽。由于多肽的直接合成法一般只适合合成一些比较小的肽段，而生物合成法则可以合成一些更加复杂的物质，进行一些更为复杂的修饰；并且生物合成法随着细胞和微生物培养表达技术逐渐成熟和完善，代价在不断降低，培养和表达的效率也在不断提升，这些原因使得多肽等生物大分子的获取方法中生物合成法逐渐成为主流。

       其中直接合成法的特点是直接合成多肽本身而难以进行复杂修饰，因而得到的样品中主要杂质是合成过程中用到的各种氨基酸、副反应杂质、氨基酸缺失杂质、异构体杂质、保护基和各种有机溶剂等。直接合成法得到的样品主要采用反相层析的方法，同时离子层析、凝胶过滤层析作为补充。

       在生物合成法获取GLP-1RA的基础上进行蛋白纯化时，结合纯化难度和成本因素，一般会在细胞构建阶段就尽可能添加his标签来使用Ni离子亲和层析，纯化使用的填料为SpreX Ni-NTA Elite/MAX，然后使用阴离子、疏水或反相层析进行精纯；有的对多肽进行的修饰本身就是添加Fc片段，可以使用Pro A亲和层析纯化的方法进行粗纯，这时就不会在多肽上添加his标签，使用SpreX ProA H60/D80进行亲和层析，然后再使用离子、疏水或反相层析进行精纯。

六、毫厘产品在多肽纯化中的应用

       以上所用到的填料中SpreX ProA H60/D80、SpreX Ni-NTA Elite/MAX、Pocar QFF/SpreX Q等目前毫厘都已有成熟产品，但疏水层析、反相层析这些在多肽纯化中应用比较广泛的填料还没有对应比较成熟的产品。

       反相层析是多肽纯化的主要手段。在实际多肽的纯化过程中，很多样品进行一步反相层析即可得到纯度比较高的样品，凝胶过滤层析、离子层析、亲和层析则作为补充来进行粗纯或去除剩余的微量杂质。进行反向层析由于需要使用到较高浓度的有机溶剂，用于多肽纯化的反相层析填料粒径较小，使得层析过程压力很大，因此通常使用乙烯-二乙烯基苯或硅胶等刚性更强的材质作为反相层析介质的基架。

       亲和层析、离子层析、凝胶过滤在作为多肽粗纯的捕获手段时，对于粒径要求不高，使用琼脂糖基架的填料也可满足使用要求。而作为精纯手段分离多肽类似物时，一方面由于其分子量相对较小，需要使用粒径更小的层析介质，而粒径更小的层析介质则带来更大的反压，另一方面疏水的基质对于分子量较小的多肽有时会为层析带来更好的分离效果，所以精纯阶段的离子、凝胶过滤层析介质通常也会和反向层析一样使用乙烯-二乙烯基苯或硅胶等刚性更强的材质作为基架。